Colony PCR
Die Colony-PCR ist eine einfache Methode, um den Erfolg einer Ligation zu überprüfen. Voraussetzung ist, dass für das Insert Primer vorhanden sind.
Template Bearbeiten
Als Template reichen sehr wenige Bakterien. Diese werden durch den anfänglichen 95°C-Schritt des PCR-Programms aufgeschlossen, so dass ihre DNA zugänglich ist. Zu viele Zellen können allerdings durch ihre übrigen Bestandteile den PCR-Prozess stören. Es kann auch präparierte DNA benutzt werden.
Wenige µl einer Flüssigkultur bzw. eine Kolonie werden auf 10 µl mit MQ verdünnt und für 5 min bei 95°C denaturieren (Heizblock oder PCR-Maschine). Mehrere Kolonien können so im selben PCR-Block überprüft werden. Zur Kontrolle kann ein weiterer PCR-Ansatz mit dem Template der originalen Insert-PCR gefahren werden.
PCR-Ansatz (REDTaq™) Bearbeiten
- 12 µl 2× REDTaq ReadyMix
- 1 µl UP-Primer (100 ng/µl)
- 1 µl DOWN-Primer (100 ng/µl)
- 10 µl Template in MQ
PCR-Programm Bearbeiten
| # | Min | Sec | °C | Vorgang | Zyklen |
|---|---|---|---|---|---|
| 1. | 0 | 45 | 96 | Denaturieren | 20-40× |
| 2. | 0 | 45 | 55+ | Annealing | |
| 3. | 0 | 30+ | 72 | Elongation | |
| 4. | 10 | 0 | 72 | Last Extension | |
| 5. | ∞ | 4 | Hold | ||