DNA-Extraktion aus Agarose-Gel
Zur Reinigung von DNA über ein Agarose-Gel.
UltraClean 15, DNA Purification Kit
Bearbeiten- Bestimmung des Gewichts der Gelbande in einem 1,5-2,0 ml Eppendorfgefäß.
- Für TAE Gele: Zugabe von 3 Volumen ULTRA SALT. Gut mischen.
- Nach Salzzugabe wird das Gelstück bei 55°C-65°C inkubiert.
- Nachdem das Gelstück komplett geschmolzen ist wird 5 µl plus 1 µl per µg DNA ULTRA BIND hinzugefügt. Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
- Zentrifugation für 5 Sekunden. Überstand wird abgenommen und das Pellet mit 1 ml ULTRA WASH für 5-10 Sekunden vortexen.
- Zentrifugation für 5 Sekunden. Überstand verwerfen und noch mal 5 Sekunden zentrifugieren.
- Lösen des DNA-Pellets in Wasser oder TE-Puffer.
QIAEX II Gel Extraction Kit (150)
Bearbeiten- DNA-Bande mit sauberem, scharfen Skalpell aus dem Gel ausschneiden
- Leeres Eppi wiegen, ausgeschnittene Gelbande hineingeben, erneut wiegen
- 300 µl Puffer QX1 pro 100 mg Gel hinzugeben (wenn DNA-Fragment 100-4000 bp groß ist; wenn nicht, siehe Tabelle im Original-Protokoll)
- QIAEX II 30 sec resuspendieren durch vortexen
- 10 µl QIAEX II bei <=2 µg DNA hinzugeben, 30 µl QIAEX II bei 2-10 µg DNA
- Für 10 min bei 50°C inkubieren, alle 2 min vortexen
- Zentrifugieren 30 sec, 10.000g
- Überstand verwerfen
- Mit 500 µl Puffer QX1 waschen, vortexen
- Zentrifugieren 30 sec
- Überstand verwerfen
- 2×
- Mit 500 µl Puffer PE waschen, vortexen
- Zentrifugieren 30 sec
- Überstand verwerfen
- An der Luft trocknen lassen, bis das Pellet weiß wird (10-15 min)
- Mit 20 µl MQ oder TRIS-HCl (10 mM, pH 8.8) resuspendieren
- Zentrifugieren 30 sec
- Überstand weiterverwenden (alternativ ab #14 wiederholen für höhere Ausbeute)
Filtermethode
BearbeitenGeeignet für kurze DNA-Fragmente.
Vorbereitung des Gels
BearbeitenDie DNA sollte zwecks effizienterer Extraktion auf möglichst wenige Slots verteilt werden. Daher reichlich Gel ansetzen und die Gießkammer bis zum Rand fülle (kleines Gel: 25 ml). In einen großen Slot eines solchen Gels passen knapp 40 µl. Für größere Volumina können vor dem Gießen zwei Zacken eines Kamms durch Tesa-Film miteinander verbunden werden. Zwei so verbundene große Slots fassen nun ca. 80 µl.
Vorbereitung der Extraktion
Bearbeiten- Das Gel wird photographiert (nur kurz mit UV belichten!)
- Das Gel wird auf einen UV-Tisch gelegt. Die gewünschten Banden werden mit einem Skalpell ausgeschnitten.
- Die Extraktions der DNA aus den Gelstücken erfolgt über Zentrifugation und Filtration.
- Mit einer dünnen Kanüle werden von innen drei Löcher in den Boden eines 1,5ml-Eppis gestochen.
- Ein ca. 1x1 cm großes Stück Munktell-Filterpapier wird entlang der Diagonalen gefaltet, dann noch einmal entlang der Senkrechten.
- Durch drücken der Enden klappt ein Mini-Filter auf. Die überstehenden Ecken werden mit der Schere entfernt.
- Der Mini-Filter wird in das Eppi gedrückt (am besten mit einer Pipettenspitze), so dass er den Boden bedeckt.
- Das Eppi wird nun in ein anderes 1,5ml-Eppis gesteckt. Bei beiden Eppis wird der Deckel entfernt.
Extraktion
Bearbeiten- Das ausgeschnittene Gelstück wird in das obere Eppi (mit dem Filter) gelegt.
- Zentrifugation für 1-5 min bei 4°C und maximaler Drehzahl
- Verwerfen des Eppis mit dem Gelstück. Abhängig vom Totalvolumen der Flüssigkeit:
- Hinzufügen von 3M NaOAc (0,1x des Totalvolumens)
- Hinzufügen von Isopropanol (0,7x des Totalvolumens)
- Hinzufügen von 2 µl Glycogen-Lösung zur Sichtbarmachung des DNA-Pellets
- Zentrifugation für 30 min bei 4°C und maximaler Drehzahl
- Die Flüssigkeit wird verworfen (nicht das Pellet!)
- Hinzufügen von 1 ml kaltem 70% EtOH
- Zentrifugation für 10 min bei 4°C und maximaler Drehzahl
- Die Flüssigkeit wird verworfen (nicht das Pellet!)
- In 15 µl MQ oder TE-Puffer aufnehmen
Materialien
Bearbeiten- Agarose-Gel-Material (siehe Agarosegel), ggfs. Tesa-Film
- Kanüle, Munktell-Filterpapier, 1,5ml-Eppis, Tischzentrifuge
- 3M NaOAc, Isopropanol, 70% EtOH kalt
- ggfs. Glycogenlösung, MQ oder TE-Puffer