Gekoppelter Assay
Die Phosphorylierung ist eine optisch inaktive Reaktion, daher wird sie durch die Kopplung an den Abbau von NADH, eine optisch aktive Reaktion, übers Photometer detektierbar.
- Kinase: ATP + S --> Kinase + ADP + pS
- Pyrovat-Kinase: ADP + PEP --> ATP + Pyrovat
- Lactat-Dehydrogenase: Pyrovat + NADH + H+ --> NAD+ + Lactat
Gemessen wird die Abnahme der Konzentration an NADH anhand der Abnahme der OD340. Die Umrechnung in den Transfer erfolgt mit dem Lambert-Beer Gesetz:
- OD340 = E340 (NADH) * c * d
E340 (NADH) = 6,22 d = 1cm
Messung am Photometer im Zentrifugenraum:
- Programm: Kinetics/Time
- Dateiname eingeben (Unter B:)
- λ= 340nm, Backround: (no) 250nm
- Interval time: 20 s, Messzeit: 30-40 min
- T = 22 °C
- Tabulation/Plot: auswählen, ob lieber Graph oder Tabelle (besser Tabelle) (ist während der Messung nicht umstellbar)
- Gemessen wird in der 250 µl Quarz-Küvette
- Küvette wird mit 250 µl Tris geblanct.
Stock- Lösungen:
- LDH: 25000 u/1,4 ml --> 4,5 µl auf 250 µl Ansatz
- PK: 10 mg/ml --> 5,7 µl auf 250 µl Ansatz
- PEP: 10 mM (2 mg/ml) --> 25 µl in 250 µl Ansatz
- NADH 10 mM (7 mg/ml) --> 6 µl in 250 µl Ansatz
- MgCl2 1 M --> 7,5 µl in 250 µl Ansatz
- DTT 100 mM --> 2,5 µl in 250 µl Ansatz
- ATP 100 mM --> je nach Ansatz
- ADP 100 mM --> 1-2 µl in 250 µl Ansatz
- Tyrtide 555 µM --> 90 µl (200 µM)in 250 µl Ansatz
Da die Reaktion bei Raumtemperatur stattfindet, sollten die Lösungen mit großem Volumen auf Raumtemperatur sein (Tris, MgCl2 und Tyrtide), alles andere auf Eis!
Messung
- Alles in die Küvette geben, außer Kinase und ATP und gut mit dem Enzymlöffel mischen.
- Küvette genau wie den Blanc-Wert reinstellen und starten (Read sample), OD sollte so zwischen 1,2 und 1,5 liegen.
- ATP und Kinase handwarm machen.
- Warten, bis die OD einigermaßen konstant ist und dann ATP zugeben, umrühren und eine Messung mit Enzymlöffel in der Lösung (An dem * Ausschlag in der OD kann man später erkennen, wann ATP zugegeben wurde).
- Warten, bis die OD einigermaßen konstant ist und dann Kinase zugeben, umrühren und eine Messung mit Enzymlöffel in der Lösung (s.o.).
- 15 Minuten messen, dann durch Zugabe von ADP stoppen (OD sollte auf 0,5-0,1 runter gehen).
Speichern
- Dann auf Save/Clear Daten Speichern auf Diskette (B:/) und Namen eingeben.
- Quit (Methode nicht speichern)
- Auf File Utilities, unter KinData die Datei markieren und auf Convert klicken (Darauf achten, dass Destination B: angegeben ist.