HPLC für Peptide-Map

Durchführung

Verwendete HPLC, Trennsäule und Vorsäule
- HPLC der Firma Beckman
- Vorsäule der Firma Macherey - Nagel
- Trennsäule : Nucleogel SAX 1000 -8/46 (Firma Macherey - Nagel)
  Beim Säulenmaterial handelt es sich um einen starken basischen Anionenaustauscher mit quaternären Ammoniumgruppen. Korngröße 8 µm; Porengröße 100 nm. Es können Puffer in einem pH-Bereich von 1 bis 13 verwendet werden; die lonenstärke der Puffer darf bis 8 Mol/L betragen. Die Puffer dürfen auch Detergentien (kationische oder nicht-ionische) enthalten; anorganische Detergentien sind nicht zu empfehlen, da sie die geladenen Oberflächengruppen des Säulenmaterials überdecken.
  Der maximale Betriebsdruck beträgt 215 bar entspricht 3000 psi. Eine optimale Auflösung wird bei einer Flussrate zwischen 1 und 2 ml/min erreicht, im Bedarfsfall kann aber auch ein Fluss von bis zu 4 ml/min eingestellt werden. Nach jedem Lauf muss die Säule gespült werden (s.u.); bei einer stärkeren Verunreinigung muss sie regeneriert werden. Dazu gibt es zwei Möglichkeiten:
  1. beim Spülen die Säule umdrehen, so dass Verunreinigungen, die am Säuleneingang liegen, herausgespült werden
  2. Waschen mit 0.1 M Essigsäure oder Salzsäure und mit 0.1 M Natronlauge. Nach jedem Waschen muss erneut mit einem Niedrigsalz- und einem Hochsalzpuffer eluiert werden.
Ansetzen der Puffer für die Gradientenelution
- Puffer A: 20 mM Ammoniumacetat (NH₄O-AC), mit 0.1% NH₄OH auf pH 7 einstellen
- Puffer B: 1 M Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄, mit 10% o-Phosphorsäure auf pH 4 einstellen
- Die Puffer müssen vor dem Gebrauch vakuumfiltriert (ME 24-Membranfilter, 0.2 µm) und entgast werden.
  Puffer A hält sich nur 1-2 Tage!
Vorbereitung der HPLC
1. HPLC einschalten (auf der Rückseite), das Display und die drei rechten Kontrolllampen (unter dem Display) leuchten auf.
2. Zuerst werden die Pumpen A und B mit den entsprechenden Puffern gespült (Pumpe A mit Puffer A, Pumpe B mit Puffer B). Dazu werden die Schläuche mit den Fritten in die entsprechenden Pufferflaschen gehängt (die Schläuche sind mit A bzw. B gekennzeichnet). Am besten werden die Schläuche durch einen Papierpfropfen im Flaschenhals festgeklemmt, so dass die Fritten am Flaschenboden bleiben (sonst besteht die Gefahr, dass Luft angesaugt wird!). Vor dem Spülen der Pumpen muss das Ventil (runder schwarzer Knopf in der unteren Hälfte der Pumpenabteilung) aufgedreht werden; die geförderten Flüssigkeiten laufen dann nur durch die Pumpen, nicht durch die Säule.
3. Spülen von Pumpe A: Eine 10 ml-Spritze wird auf den Stutzen von Pumpe A gesetzt, dann wird der Hebel von Pumpe A auf PRIME LINE gestellt. Mit der Spritze 5 - 10 ml Puffer aufziehen (so viel Puffer, bis man keine Luftblasen mehr aufzieht). Hebel auf OPERATE zurückstellen; Puffer in der Spritze verwerfen. Die Prozedur wiederholen (PRIME LINE - aufziehen, OPERATE - aufgesaugten Puffer verwerfen, PRIME LINE - aufziehen). Dann wird der Hebel auf PRIME PUMP gestellt, und der Puffer wird aus der Spritze in die Pumpe zurückgedrückt. Auf OPERATE zurückstellen.
  Dann wird auf dem Display das Pumpenfenster aufgerufen: "Menue" drücken, 3 eingeben (direkte Kontrolle), anschließend 0. Jetzt kann man Durchfluss und Pumpenleistung einstellen: 10 ml/min; duration = 0; 0 % B; duration = 0. Der eingegebene Wert ist jeweils erst dann sichtbar, wenn man für duration 0 und dann enter eingegeben hat. Durch Drücken auf F2 "flow on" (2. Taste von links) springt die Pumpe A an, es wird jetzt 0 % B, also 100 % A gefördert. Nach 2 Minuten auf "STOP" drücken.
4. Spülen von Pumpe B: die Spritze wird auf den Stutzen von Pumpe B aufgesetzt, im Pumpenfenster wird 100% B eingestellt, ansonsten wird alles genauso gemacht wie beim Spülen von Pumpe A.
  Beim Spülen der Pumpen ist darauf zu achten, dass beim Aufziehen der Flüssigkeit bei der Einstellung PRIME LINES keine Luftblasen mehr zwischen Pufferflasche und Spritze zu sehen sind; wenn Luft ins System kommt, stimmt das Gradientenprofil beim Lauf nicht mehr, und die Trennung ist nicht reproduzierbar.
5. Spülen der Probenschleife: um Verunreinigungen durch Reste einer früheren Probe zu vermeiden, wird die Probenschleife 4 - 5 x mit Puffer A gespült
6. Waschen und Äquilibrieren der Säule: das schwarze Ventil wird wieder zu gedreht, so dass jetzt die Puffer durch die Säule gefördert werden. Achtung: Flussrate ändern! (Menue - 3 - 0 - 1 ml/min einstellen und je nach Bedarf 0 oder 100% B einstellen, dann F2 drücken).
  1. Waschen der Säule: 5 Minuten Puffer B durchlaufen lassen (1 ml/min)
  2. Äquilibrieren der Säule: 20 Minuten Puffer A durchlaufen lassen (1 ml/min)
Vorbereitung der Proben
- Die aus dem Gel ausgeschnittenen radioaktiven Banden werden tryptisch eluiert; dabei ist die Durchführung die gleiche wie für eine (Phosphoaminosäure-Analyse), jedoch muss TPCK-Trypsin verwendet werden (keine Chymotrypsin-Aktivität).
- Die Proben werden nach der tryptischen Elution mit Puffer A auf 1.1 ml aufgefüllt und anschließend gut zentrifugiert, da eventuell vorhandene kleine Gelstückchen zu einer Verunreinigung der HPLC und damit zu nicht reproduzierbaren Läufen führen. Auch Spuren von Fett in der Probe wirken sich ungünstig auf die Trennung und auf die Lebensdauer der Säule aus.
Durchführung des Peptide Mapping
- Die verdünnte und zentrifugierte Probe wird in die Probenschleife eingespritzt; dabei muss der Hebel an der Probenschleife auf "Load" stehen. Die HPLC wird für die Trennung der Probe folgendermaßen eingestellt:
- Der Fluss wird auf 0,5 ml/min, 0% B gestellt.
- Dann wird das Menü-Fenster aufgerufen, durch Anwählen von "Methods" ("2") erscheint der Methoden-Bildschirm.
- Sobald "3" ("Start Method") gedrückt wird, erscheint für einige Sekunden die Anzeige "System started"; automatisch wird jetzt der eingestellte Gradient gestartet.
  Gleichzeitig wird der Hebel an der Probenschleife auf "Inject" umgelegt.
- Um auf das Kontrollfenster zurückzukehren, wird wieder das Menufenster aufgerufen, dann wird nacheinander ,"3" (direct control) und "0" (für das Pumpenfenster) gedrückt. Hier ist jetzt rechts oben die Laufzeit abzulesen; "%B" gibt Auskunft über den Aufbau des Gradienten. Der Gradient ist nach 120 Minuten beendet.
Vorbereitung des Fraktionssammlers
- Wenn die Peptide nach dem HPLC-Lauf noch weiterverarbeitet werden sollen (z.B: saure Hydrolyse zur Bestimmung der Aminosäuren-Zusammensetzung), müssen sie nach der Trennung fraktioniert aufgefangen werden. Der Fraktionssammler kann u.a. mit Eppendorf-Reaktionsgefäßen bestückt werden; das Rad mit den Röhrchen kann durch leichtes Anheben entriegelt werden, so dass das 1. Röhrchen an die Startposition (hinten Mitte) gerückt werden kann.
- Bei der eingestellten Laufgeschwindigkeit der HPLC (0.5 ml/min) empfiehlt es sich, den Fraktionssammler auf l Minute einzustellen; das Volumen der Fraktionen beträgt somit 0.5 ml. Nach dem Einschalten des Fraktionssammlers wird erst auf den linken Knopf gedrückt; jetzt kann mittels des rechten Knopfes entweder die Tropfenzahl pro Fraktion oder die Zeit eingestellt werden (s. Symbole).
  Um den Fraktionssammler zu starten, wird der Schlauchhalter nach vome gezogen, so dass sich das Schlauchende über dem ersten Röhrchen befindet; durch Drücken auf den linken Knopf beginnt das fraktionierte Sammeln.
Analyse des Eluats
- Die Fraktionen werden im Counter gezählt; aus den erhaltenen Daten wird das Elutionsprofil erstellt.
Spülen der Säule nach dem Lauf
1. vor Auftragen einer neuen Probe: Die Säule wird mindestens 5 Minuten lang mit Puffer B gespült, anschließend wieder mindestens 20 Minuten lang mit Puffer A äquilibriert (1 ml/min). Man kann die HPLC beim Einstellen des Gradienten auch so programmieren, dass das Spülen automatisch erfolgt. Nach dem Spülen wird die Flussrate auf 0.5 ml/min zurückgestellt; dann kann die neue Probe aufgetragen werden.
2. nach Beendung der Trennungen: Die Säule wird wie oben beschrieben mit Puffer B gespült, um Reste der Probe zu entfernen. Dann werden die Pufferschläuche in MQ-H₂0 + 0.2% Na-Azid gehängt. Zunächst werden die Pumpen wie oben beschrieben mit H₂0 gespült, anschließend die Säule mindestens 20 Minuten lang gespült. Zum Schluss wird die Pumpe ausgestellt ("Stop") und die gesamte Anlage ausgeschaltet.

Material

Puffer A	Konzentration	für 1 Liter
Ammoniumacetat (NH₄O-AC)	20 mM	1,54 g
mit 1.0 - 0.1% Ammoniumhydroxid (NH₄O-AC) auf pH 7 einstellen

Puffer B	Konzentration	für 1 Liter
Kaliumdihydrogenphosphat (KH₂PO₄) (Vorsicht, es gibt auch 3xH₂O [trihydrat])	1 M	68,05 g
mit 10% o-Phosphorsäure auf pH 4 einstellen

Die Puffer müssen vor dem Gebrauch vakuumfiltriert (ME 24-Membranfilter, 0.2 µm) und entgast werden.
Achtung: Puffer A ist flüchtig. Entweder nur kurz entgasen, oder mit entgastem MQ ansetzten.
Puffer A hält sich nur 1-2 Tage!