Institut:Biochemie/Gluthation Sepharose Reinigung
Methode
BearbeitenHerstellung der Säule
Bearbeiten- Leere Säule (geeignet: benutzte NucleoBond-Säule) und Teflon-Einlage mit MQ und Ethanol spülen
- Doppeltes Zielvolumen der Säule an Glutathion-Sepharose einfüllen (im Kühlraum)
- PBS-Puffer frisch ansetzen
- Mit 20× Säulenvolumen PBS spülen
- Auslauf schließen, etwas PBS stehen lassen (Säule darf nie trocken laufen!)
Proteinreinigung
Bearbeiten- Säule mit 3× Säulenvolumen an PBS äquilibrieren
- Proteinlösung (z.B. Überstand einer Zentrifugation) auf die Säule geben, je 50 µl von Überstand und Durchlauf in Eppis auffangen
- Für Proteine aus E. coli (zur ATPase-Entfernung) :
- Mit 5-10× Säulenvolumen PBS waschen
- Bei Raumtemperatur mit 10× Säulenvolumen ATPase-Entfernungs-Puffer waschen
- Säule mit 5-10× Säulenvolumen 1M NaCl (in 50 mM Tris, pH 7,5) waschen, 50 µl Durchlauf in Eppi auffangen
- Säule mit 5-10× Säulenvolumen an PBS waschen, 50 µl Durchlauf in Eppi auffangen
- Säule 4× mit 2× Säulenvolumen Elutionspuffer eluieren
- Säule 3× abwechselnd mit je 15 ml Regenerationspuffer 1 und Regenerationspuffer 2 regenerieren
- Säule in 20% Ethanol lagern
- Eluate bei -80°C einfrieren
- Eingeengtes Protein in 50 µl Aliquots in 0,5 ml Eppis füllen, in flüssigem Stickstoff schockgefrieren, bei -80°C lagern
Materialien
Bearbeiten- Säule mit Tefloneinlage (z.B. NucleoBond-Säule), PBS-Puffer
- 3 kleine, 5 2ml Eppis
- Glutathion-Sepharose-Regenerationspuffer I (0.5 l)
- Tris (MW=121.14) : 6.06 g (Endkonzentration 0.1M)
- NaCl (MW=58.44) : 14.61 g (Endkonzentration 0.5M)
- Mit HCl auf pH 8.5 einstellen, filtrieren
- Glutathion-Sepharose-Regenerationspuffer II (0.5 l)
- Na-Acetat (MW=82.03) : 4.1 g (Endkonzentration 0.1M)
- NaCl (MW=58.44) : 14.61 g (Endkonzentration 0.5M)
- Mit Essigsäure auf pH 4.5 einstellen, filtrieren
- Glutathion-Sepharose-Elutionspuffer
- Tris-HCl 50 mM pH 8.5 (0.121g in 20 ml bzw. 0.182g in 30 ml MQ lösen)
- direkt vor Gebrauch reduziertes L-Glutathion hinzugeben (0.0615g in 20 ml bzw. 0.09219g in 30 ml) → Endkonzentration 10 mM mit pH ~8.0
Elutionspuffer (20 ml) | Regenerationspuffer 1 (0,5 l) | Regenerationspuffer 2 (0,5 l) | |
---|---|---|---|
Tris (MW=121.14) | 0,121 g (EK 50 mM) | 6,06 g (EK 0,1 M) | |
NaCl (MW=58.44) | 14,61 g (EK 0,5 M) | 14,61 g (EK 0,5 M) | |
Na-Acetat (MW=82.03) | 4,1 g (EK 0,1M) | ||
L-Glutathion (reduziert) | 0.0615 g (EK 10 mM) | ||
einstellen auf pH | s. Beschreibung im Text | 8.5 | 4.5 |
mit | HCl | Essigsäure |
ATPase-Entfernungs-Puffer
BearbeitenErst direkt vor Gebrauch ansetzen!
- 0,076g (→2,5mM) ATP (nicht das teure verwenden!)
- 0,1012g (→10mM) MgCl2
- In 50 ml 50mM TRIS lösen
- Auf pH 7.5 einstellen