Institut:Biochemie/PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten.
Methode
BearbeitenDie zu amplifizierende DNA wird in mehreren Zyklen kopiert, wobei die Zahl der Kopien exponentiell ansteigt. Die Anzahl der Zyklen beträgt in der Regel 20-50, und wird der erwarteten Genauigkeit der Amplifikation angepasst. Jeder der Zyklen besteht prinzipiell aus folgenden Schritten:
- Denaturierung der Matrizen-DNA bei 95°C
- Hybridisierung (Annealing) der Oligonikleotidprimer an die Enden der Zielsequenz (Temperatur ist abhängig vom Schmelzpunkt der Primer Tm). Je höher die Temperatur, desto spezifischer ist die Hybridisierung
- Elongation durch eine hitzestabile DNA-Polymerase bei 72°C (~2 min/1000 Basenpaare)
Standardansatz (50 µl)
Bearbeiten5 µl 10× Pfu Puffer 1 µl PCR-Nukleotidmix (dNTP) 1 µl 100 ng/µl Matrizen-DNA (Template); bei Kontrollansatz 1 µl MQ 1,25 µl 100 ng/µl Primer up 1,25 µl 100 ng/µl Primer low 1 µl Pfu-Polymerase 39,5 µl MQ
Standardprogramm
Bearbeiten# | Min | Sec | °C | Vorgang | Zyklen |
---|---|---|---|---|---|
1. | 0 | 45+ | 96 | Hotstart | |
Jetzt Polymerase dazugeben | |||||
2. | 0 | 45 | 96 | Denaturieren | 20-30× |
3. | 0 | 45 | 55+ | Annealing | |
4. | 0 | 30+ | 72 | Elongation | |
5. | 10 | 0 | 72 | Last extension | |
6. | ∞ | 4 | Hold |
Merksätze
Bearbeiten- Gelieferte Primer zu 1 µg/µl in MQ lösen.
- Fremde Templates durch Restriktionsenzymspaltung oder Sequenzierung auf Korrektheit überprüfen!
- Hast Du keine Primer mehr, fällt die PCR Dir schwer.