Kultivierung einer mit M13 infizierten E. Coli Kultur. 3ml LB – Medium werden 1:100 mit Übernacht – Kultur ER2738 angeimpft. Anschließend wird Plaque einer Titerbestimmung gepickt und zu der Kultur gegeben. Ist kein Plaque vorhanden kann die Kultur auch mit 5µl des Phagen – Überstandes angeimpft werden, wobei aber das Picken von Plaques zu bevorzugen ist. Die Kultur wird 4,5 – 5 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Auch hier gilt, zu lange Inkubation begünstigt Deltionsmutanten und zudem kann es zur Verunreinigung der Proben durch chromosomale DNA von lysierten Zellen kommen.
Zentrifugation der Kulturen bei 5000rpm für 15min bei RT.
Abnehmen des Überstandes in frische Reaktionsgefäße. Hierbei darf das Pellet nicht gestört werden, um keine Bakterien zu verschleppen.
Rezentrifugation des Überstandes wie oben. Hierdurch kann sichergestellt werden, dass der Überstand wirklich sauber ist. WICHTIG: Ein Teil der Phagenlösung (ca. 50µl) sollten aufbewahrt werden, um eine Reserve für spätere Amplifikationen zu haben.
Zugabe von 1/100 Volumen Puffer MP zur M13 Prezipitation(30µl), anschließend vortexen und bei Raumtemperatur min. 2 min inkubieren. Bei diesem Schritt werden die Phagen aus dem Medium prezipitiert.
Säule auf ein frisches 2ml Eppendorf – Reaktionsgefäß geben und Auftragen von 700µl der Probe auf das Säulchen. Das Beladen der Säulchen muss in 700µl Schritten erfolgen, da die Säulen nicht mehr Volumen fassen können.
Zentrifugation 15sec bei 8000rpm und RT in einer Eppendorf – Zentrifuge, Durchfluss verwerfen. Hierbei werden die intakten Phagen auf der Säule zurück gehalten.
Wiederholung der Schritte 6 und 7 bis die gesamte Probe aufgebracht ist.
Zugabe von 700µl Puffer MLB, zur M13 Lyse und Bindung, auf das Säulchen. Anschließende Zentrifugation 15sec, 8000rpm, RT. Die Säule wird äquilibriert und die Lyse der Phagen beginnt.
Zugabe von weiteren 700µl Puffer MLB auf das Säulchen. Inkubation für 1min bei RT zur vollständigen Lyse der Phagen. Zentrifugation: 15sec, 8000rpm, RT. Nach der Lyse werden die Proteine von der bindenden ssDNA getrennt.
Waschen mit 700µl Puffer PE und Zentrifugation 15sec, 8000rpm, RT. Überschüssiges Salz wird hier entfernt.
Der Durchfluss wird verworfen und die Säule erneut zentrifugiert, wie oben. In diesem Schritt wird das Ethanol entfernt, welches bei weiteren Reaktionen stören würde.
Säule auf ein frisches 1,5ml Eppendorf – Reaktionsgefäß geben und Auftragen von 100µl auf 50°C vorgewärmten Puffer EB (10mM Tris/HCl, pH 8,5) in die Mitte der Säulenmembran. Inkubation 10min bei RT und abschließende Zentrifugation für 30sec bei 8000rpm und RT.
Die Konzentration der erhaltenen DNA wird photometrisch bestimmt (siehe DNA-Konzentrationsbestimmung mit dem Photometer) und kann sequenziert werden.
