Die Übernacht – Kultur aus Schritt 27 der Selektion wird 1:100 in LB Medium verdünnt. Anschließend wird pro zu pickenden Klon 3ml der Verdünnung in ein Falcon Tube gegeben. Zu Beginn sollten 10 Klone untersucht werden, oft reicht dies laut NEB, um eine Konsensusequenz zu finden.
Mit einer sterilen Eppendorfpipettenspitze wird ein blauer Plaque gepickt und in ein Falcon Tube überführt, dabei verbleibt die Spitze in der Kultur. Wichtig: Es sollten nur Plaques von solchen Platten gepickt werden, die nicht mehr als ca. 100 Plaques aufzeigen, um eine Kreuzkontamination von mehreren Phagenklonen zu vermeiden.
Die Ansätze werden für 4,5 Stunden bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Wichtig: Die Inkubationszeit sollte nicht 5 Stunden überschreiten, da sonst Deltionsmutanten mit stark erhöhter Wahrscheinlichkeit auftreten können.
Die Kulturen werden in Eppendorf – Reaktionsgefäße gegeben und für 30 Sekunden bei max rpm und RT zentrifugiert. Der Überstand wird jeweils in ein neues Gefäß gegeben und wie oben zentrifugiert. Die oberen 80% des 2. Überstandes werden wiederum in ein neues Gefäß gegeben. Diese Lösung ist der amplifizierte Phagen-Stock. Er kann bei 4°C für mehrere Wochen gelagert werden, ohne eine große Veränderung im Titer zu erfahren. Für längere Lagerung ist es ratsam einen Glycerolstock anzulegen, wie oben beschrieben.
