Phage Display-Titerbestimmung

Titerbestimmung von M13 Phagen Bearbeiten

5-10 ml LB Medium werden mit einer Übernacht-Kultur oder mit einem von einer LB-Tet-Agar-Platte gepickten Klon angeimpft und bis zu einer OD600 von ca. 0,5 herangezogen.
Während die Zellen wachsen wird ein Wasserbad auf 45°C vorgeheizt, anschließend wird Agarose-Top in der Mikrowelle geschmolzen und pro zu untersuchenden Klon eine Menge von 3ml in ein steriles Falcon Tube gegeben. Die Tubes werden im 45°C Wasserbad bis zum Gebrauch äqulibriert.
Pro Klon und Verdünnung wird eine LB/IPTG/Xgal Platte bei 37°C vortemperiert.
Es wird eine 10-fache Verdünnungsreihe der Phagen angesetzt. WICHTIG: Für amplifizierte Phagen sollten die Verdünnungen 10⁸-10¹¹ untersucht werden. Für unamplifizierte Eluate sollten die Verdünnungen 10¹-10⁴ untersucht werden.
Wenn die Zellen gut angewachsen sind werden 200µl pro Verdünnung abgenommen und in ein Eppendorf – Reaktionsgefäß gegeben.
Zu den Bakterien werden 10µl einer Verdünnung gegeben, wobei darauf zu achten ist, dass mit der größten Verdünnung angefangen wird, um eine Verfälschung des Titers zu vermeiden. Nach Phagenzugabe werden die Proben kurz gevortext und 1-5´ bei RT inkubiert.
Für eine Verdünnung nach der anderen werden die Zellen in die Falcon-Tubes mit Agarose Top gegeben diese dann schnell gevortext, augenblicklich auf die vorgewärmten LB/IPTG/Xgal Platten geschüttet und durch hin und her bewegen einheitlich auf der Platte verteilt.WICHTIG: Hier muss wirklich zügig gearbeitet werden, da Agarose Top sehr schnell wieder fest wird und dann erst wieder durch aufkochen flüssig wird.
Die Platten bleiben einen Moment unter der Bank stehen, bis der Agarose Top erstarrt ist (geht schnell). Dann können die Platten invertiert werden und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Am nächsten Tag werden die blauen Plaques auf den Platten ausgezählt. Hierbei sollten die Plaques in einer Größenordnung um die 100 liegen. Um den Titer zu errechnen muss die Zahl der Plaques mit der Verdünnung multipliziert werden und durch die Menge an eingesetzter Phagenlösung (10µl) geteilt werden, so erhält man einen Titer von [pfu/µl].

Der E. Coli Wirts-Stamm ER2738, der von NEB mitgeliefert wird ist ein robuster F+ Stamm, welcher eine schnelle Verdopplungsrate hat, eine Tetracyclin Resistenz trägt und sehr gut zur M13 Propagation geeignet ist. Obwohl ER2738 ein recA+ Stamm ist wurden laut NEB niemals spontane Rekombinationsereignisse in vivo mit M13 oder anderen Phagemid-Vektoren beobachtet. Der M13 Phage ist ein Bacteriophage, der spezifisch für männliche Bakterien ist. Deshalb muss darauf geachtet werden, dass alle Kulturen, die zur Vermehrung des Phagen benutzt werden, in einem Medium gehalten werden, welches den F-Faktor selektioniert, in diesem Fall über die Tetracyclin-Resistenz. Kulturen sollten immer von einem Klon eines Verdünnungsausstriches ausgehen. Hierzu wird von dem Glycerol-Stock auf eine LB-Tet Platte ausgestrichen und diese anschließend über Nacht bei 37°C inkubiert. Diese Platte kann einen Monat mit Parafilm abgedichtet bei 4°C im Dunklen aufbewahrt werden. Die zu infizierenden Kulturen können sowohl in LB, als auch in LB-Tet Medium herangezogen werden, da der Verlust des F-Faltors in der Zeitspanne von max. 5 Stunden unerheblich ist. Nur bei serieller Verdünnung dieser Kulturen könnte es zu einem Problem kommen, weshalb Übernacht-Kulturen immer in LB-Tet Medium zu machen sind.