Phosphorylierung

Daher:

• IGF : 58,8 pmol/µl
• Peptid : 300 pmol/µl

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Beispiel

• IGF 2 µg/µl, 34 kDa
• Peptid 1,5 µg/µl, 5 kDa
• 6 verschiedene molare Verhältnisse (1:1, 1:10, 1:20, 1:30, 1:50, 1:100)
• 5 verschiedene Zeiten (0, 5, 15, 30, 60 Minuten)
• Reaktion findet bei Raumtemperatur statt

Berechnung

Konzentration (in picoMol)

Cx [pmol/µl]=	1.000 * Cx [µg/µl]
	MWx [kDa]

Endkonzentration IGF soll 2 µM/µl betragen
70 µl je Ansatz (5 Zeitwerte + 2 zur Sicherheit, je 10 µl)

Berechnung der µl IGF pro Ansatz

x =	2 µM * 70 µl	= 2,38 µl = ca. 2,4 µl
	58,8 pmol/µl

6 Ansätze à 70 µl

IGF:Peptid	IGF	Peptid	KP	TRIS
1:1	2,4 µl	0,4 µl	7 µl	60,2 µl
1:10	2,4 µl	4,6 µl	7 µl	56,0 µl
1:20	2,4 µl	9,3 µl	7 µl	51,3 µl
1:30	2,4 µl	14,0 µl	7 µl	46,6 µl
1:50	2,4 µl	23,3 µl	7 µl	37,3 µl
1:100	2,4 µl	46,6 µl	7 µl	14,0 µl
TRIS : 50mM pH7.5; KP = 10× Kinasepuffer IGF:Peptid meint das molare Verhältnis

Durchführung

1. 5 Zeitwerte × 6 molare Verhältnisse = 30 Eppis vorbereiten, SDS-Probenpuffer oder Quenching-Puffer (für native Gelelektrophorese) in jedes Eppi geben

1. Alles bis auf Kinasepuffer zusammenpipettieren
2. Ggfs. Nullwerte (Zeit=0) entnehmen (nur 6 µl)
3. Zeit startet bei der Zugabe von Kinasepuffer; festes Zeitschema wählen (z.B. 20 Sekunden pro Ansatz)
4. Bei jedem Zeitwert aus jedem Ansatz 10 µl entnehmen (Zeitschema beachten), in vorbereitetes Eppi geben, ggfs. kurz anzentrifugieren (bei Verwendung von Quenching-Puffer Eppi auf Eis stellen)
5. Die Proben können über Nacht bei -20°C gelagert werden

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Materialien

Kinasepuffer 10× 100 µl ATP 100 mM 20 µl 0,5M oder 40 µl 0,25M MgCl2 200 mM 30 µl 1M TRIS pH 7.5 50 mM 10 µl 0,5M DTT 10 mM 1 µl 1M TRIS 39 (bzw. 19) µl 50mM pH 7.5 !ATP in 50 mM TRIS oder HEPES auf pH 7.0 einstellen!

Quenching-Puffer 4× 100 µl 10 ml EDTA 0,5M 50 µl 5 ml TRIS 3M 12,5 µl 1,25 ml 1M DTT 10 µl 1 ml Saccharose 60% 26,5 µl 2,65 ml 1% Bromphenolblau 1 µl 100 µl