Plaque Assay

Plaque Assay zur Herstellung von Virusklonen und zur Bestimmung des Virustiters.

Abkürzungen:

MOI : multiplicity of infection, = plaque forming units pro Zelle
Pfu : plaque forming units

Zellen zählen, sollen in log-Phase (1,0-1,2×10⁶/ml) sein und gesund
kleine Petrischalen (ca. 4,5cm Durchmesser): für jede Verdünnungen (1. Überstand Beginn mit 10^-2 und 2. Überstand Beginn mit 10^-3) zwei Schalen beschriften (Doppelbestimmung), zusätzl. Nullwert. An einer Seite mit senkrechtem Strich markieren, dort wird zu- und abpipettiert
ca. 2ml Medium in jede Petrischale geben, verteilen
in jede Schale 1,5-2,0×10⁶ Zellen geben, verteilen, ca. 10-15 min stehen lassen, bis die Zellen angeheftet sind (Mikroskop)

zwischenzeitlich:

- Virus (Virusüberstand) mit Medium (AB+) verdünnen (je 2,7ml Medium + 300µl Überstand); Eppendorfpipette mit Ethanol außen und innen reinigen
- beim ersten Assay nach der Transfektion: 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5, später stärker verdünnen, so dass 3 Konzentrationsbereiche ausgewertet werden können
Medium aus den Schalen mit steriler Pasteurpipette, Schlauch und Vakuumpumpe absaugen (Schlauch außen und innen mit Ethanol reinigen); zum Absaugen Schälchen schräg halten, an markierter Stelle absaugen
sofort 1ml Virusverdünnung auf die Zellen geben, je 2 Schälchen; mit Nullwert (+Medium) beginnen, dann höchste Virusverdünnung
Schälchen in große Petrischale legen, im Brutschrank für 1h inkubieren, dabei alle 15 min bewegen
Wasserbad auf 45°C anstellen. Für jede Petischale wird 5 ml Agarosemedium (0,5 %) benötigt. Dafür nötiges Medium (etwas mehr) auf 2 Falcons aufteilen und bei 45°C warmstellen. Agarose (Seakem Agarose, 5% in Wasser) in der Mikrowelle aufkochen
Sobald das Medium warm ist, 1/10 Endvolumen Agaroselösung zugeben, vortexen, und ins 40°C Wasserbad stellen, bzw. das Wasserbad mit Medium auf 40°C abkühlen lassen
Überstand aus den Schälchen absaugen. Wichtig: Alles Medium entfernen. Dazu 1ml Eppendorfpipette benutzen. Sofort vorsichtig 5 ml Agarosemedium zugeben. (je eine 10ml Pipette / Verdünnung)
Petrischälchen halb geschlossen unter der Sterilbank stehenlassen, bis die Agarose fest ist (ca 15 min)
Eine große Petrischale mit einem feuchten Papiertuch auslegen, Schälchen darin im Brutschrank 6-10 Tage inkubieren, bis der Boden mit Zellen zugewachsen ist. Danach sollten die Plaques als durchscheinende Flecken im Zellrasen sichtbar sein

Sichtbarmachen der Plaques mit Neutralrot

Neutralrot: Stock 1mg/ml in incomplete Grace-Medium, sterilfiltriert, bei 4°C im Dunkeln aufbewahrt.

pro Schälchen werden 3 ml Lösung benötigt. Benötigtes Medium mit 1/20 des Endvolumens mit Neutralrot versetzen und bei 45°C warmstellen. In 2 Falcons aufteilen, siehe Agaroselösung beim Plaqueassay
Agarose in der Mikrowelle aufkochen, 1/10 des Endvolumens zum Medium geben, ins 42°C Wasserbad stellen (ca. 30 min)
3 ml davon vorsichtig auf die Petrischalen geben, (10er Einmal-Pipette benutzen, bis 12 ml aufziehen, 4 Schälchen damit überschichten); offen stehenlassen, bis die Agarose erstarrt ist
nach einigen Stunden und am nächsten Tag kontrollieren: Plaques erscheinen hell im roten Zellrasen

Picken von Plaques

Plaques am Boden des Schälchens mit Glasschreiber markieren
mit kurzer Pasteurpipette (mit Hütchen) von oben senkrecht anstechen und Agarpfropfen vorsichtig hochsaugen
in 1 ml Medium aufnehmen, in 15 ml Falcon geben, whirlmixen
10 bis 20 Plaques picken; können im Kühlschrank aufbewahrt werden