Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese mit Harnstoff zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen. Nach Größe werden Proteine getrennt. Urea-Gel kann phosphoryliertes Protein von unphosphoryliertem Protein mit größerem Abstand als SDS-PAGE trennen.

  1. 10 ml Trenngel (+APS+TEMED) in Glassplatten-Sandwich geben
  2. mit etwas MQ bedecken
  3. ca. 45 min warten, bis das Gel fest wird
  4. MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
  5. Sandwich mit Sammelgel (+APS+TEMED, ca. 5 ml) füllen
  6. Kamm einsetzen
  7. ca. 30 min warten, bis das Gel fest wird
  8. Unterseite der Slots mit Stift markieren
  9. Sandwich in Laufkammer stellen (weiße Platte zur Mitte hin orientieren)
  10. Mitte der Laufkammer mit Harnstoffgel-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind.
  11. Den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
  12. Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, Pipette nach jeder Probe in Laufpuffer spülen
  13. Mit 290 Volt laufen lassen. Alternative:
    1. Beim Raumtemperatur läuft die Färbungsfront bei 26min aus, und das Gel soll ca. 1h laufen.
    2. Bei 0,5°C konnten wir gute Ergebnisse mit Laufzeiten von 2h30' erzielen (zur Trennung von phosphoryliertem und unphosphoryliertem tyrTide).
  14. Kammer in den Ausguss entleeren, sehr gründlich mit Wasser spülen

optional:
Harnstoffgele konnten gut gefärbt und anschließend auch in MQ entfärbt werden (ohne dass sich die Proteinbanden entfärbten).
Zur Trocknung Gel Ü/N in MQ entfärben, dann für 2h in 20% Glycerin legen und für 30' bei 80°C und für 20' bei offenem Deckel unter Vakuum trocknen.

Materialien

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Andere Materialien

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  • APS=40% Ammonium-Persulfat ( 0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
  • 240mM Tris-Glycine (14.5 g Tris, 80 g glycine auf 500 ml Endvolumen)
  • 1M Tris-HCl, pH 6.8
  • 2X urea-Probenpuffer


Trenngel (10 ml)

  • 4.8 g urea (für 8 M Endkonzentration)
  • 1.9 ml 40% Acrylamid
  • 833 µl 240mM Tris-glycine
  • mit MQ auf 10 ml auffüllen
  • 6.6 µl TEMED
  • 12,5 µl 40% APS


Sammelgel (10 ml)

  • 4.8 g urea
  • 870 µl 40% Acrylamid
  • 1,43 ml 0,5M Tris pH 6.8
  • mit MQ auf 10 ml auffüllen
  • 10 µl TEMED
  • 12,5 µl 40% APS


Lauf-Puffer

  • 83.3 ml of 240 mM Tris-glycine diluuted to 1L in water