Institut:Biochemie/SDS-PAGE

Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen.

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Methode

1. 10 ml Trenngel (+APS +TEMED) in Kassette geben
2. mit etwas MQ bedecken
3. warten bis das Gel fest wird (ca. 45 min)
4. MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
5. Kassette mit Sammelgel (+APS +TEMED) füllen (ca. 5 ml)
6. Kamm einsetzen
7. warten bis das Gel fest wird (ca. 30 min)
8. währenddessen Heizblock auf 95°C stellen, Proben ca. 5 min kochen
9. Unterseite der Slots mit Stift markieren
10. Kamm und Klebestreifen entfernen
11. Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
12. Mitte der Laufkammer mit SDS-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind; es darf kein Puffer auslaufen
13. den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
14. Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in SDS-Laufpuffer spülen
15. mit 20 mA laufen lassen, bis die Proben das Sammelgel verlassen haben, dann mit 30 mA im Trenngel
16. Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
17. Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
18. Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen

Weitere mögliche Schritte:

• Gel auf Lichttisch fotographieren
• Western Blot
• Gel trocknen
  1. Gel und Einmach-Folie in MQ legen
  2. Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
  3. Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
  4. auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
  5. mit Vakuum für ca. 1 h mit Hitze, danach für ca. 15 min ohne Hitze trocknen
  6. falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen

Materialien

Trenngel

[ml]	7%	10%	12%	15%	18%	100ml 12%
3M TRIS, pH 8,8	1,85	1,85	1,85	1,85	1,85	18,5
20% SDS	0,05	0,05	0,05	0,05	0,05	0,5
60% D(+)-Saccharose	1,15	1,15	1,15	1,15	1,15	11,5
50% Acrylamid (100:2,7) MQ	1,40 5,55	2,00 4,95	2,40 4,55	3,00 3,95	3,60 3,35	24,0 45,5
40% Acrylamid (37,5:1) MQ	1,75 5,20	2,50 4,45	3,00 3,95	3,75 3,20	4,50 2,45	30,0 39,5
30% Acrylamid (100:2,7) MQ	2,30 4,65	3,30 3,65	4,0 2,95	5,00 1,95	6,00 0,95	40,0 29,5
10 ml Trenngel; + 10,4 µl APS + 4,4 µl TEMED

Sammelgel

[ml]	10 ml		50 ml		200 ml
	4%	6%	4%	6%	4%	6%
0,5M TRIS pH 6,8	2,5	2,5	12,5	12,5	50	50
20% SDS	0,05	0,05	0,25	0,25	1	1
50% Acrylamid (100:1) MQ	0,80 6,65	1,20 6,25	4,0 33,25	6,0 33,25	16 133	24 125
40% Acrylamid (37,5:1) MQ	1,00 6,45	1,50 5,95	5,00 32,7	7,50 29,75	20 129	30 119
30% Acrylamid (100:2,7) MQ	1,20 6,25	2,00 5,45	6,00 31,25	10,00 27,25	24 125	40 109
10 ml Sammelgel; + 12,5 µl APS + 10 µl TEMED

SDS-Laufpuffer	1×	5×	5×, 2l
mM TRIS (121,14 g/mol)	50	250	60,6g
% SDS	0,1	0,5	10,0g
mM Glycin (75,07 g/mol)	384	1920	288g

50% (Bis-)Acrylamid (100:2,7)

• 48,65 g Acrylamid
• 1,35 g Bis-Acrylamid
• mit MQ auf ca. 75 ml auffüllen
• Acrylamid vollständig auflösen
• auf 100 ml auffüllen
• durch 0,45 µM Filter geben

Andere Materialien

• APS=40% Ammonium-Persulfat (0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
• SDS-Probenpuffer
• ggfs. Einmach-Folie