Institut:Biochemie/Western Blot
Beim Western Blot werden die Proteine aus einer SDS-PAGE auf eine PVDF-Membran übertragen. Dort können sie mit Hilfe von Antikörpern sichtbar gemacht werden.
Methode
BearbeitenElektroblot
Bearbeiten1. Variante
- Die untere Graphitplatte (+, Anode) anfeuchten
- 12 Munktell-Filter (5,5x8,5 cm) in 1x Blotpuffer getränkt als Unterlage, ggfs. mit Glaspipette glattstreichen
- Membran kurz in Metanol aktivieren, in MQ wässern, in Blotpuffer legen
- Membran auf die Munktell-Filter legen, Oberseite in einer Ecke mit Bleistift-Kreuz markieren
- Gel auflegen
- 12 Munktell-Filter (5,5x8,5 cm) in 1x Blotpuffer getränkt auflegen, ggfs. mit Glaspipette glattstreichen
- Die obere Graphitplatte (-, Kathode) auflegen
- mit 90 mA (~2mA pro cm2 Gel) ca. 15 min. laufen lassen (abhängig von Protein und Gelgröße)
2. Variante
Auf der Blot-Apperatur aufbauen
- 16 Munktell-Filter in Anodenpuffer Anodenpuffer I
- 16 Munktell-Filter in Anodenpuffer Anodenpuffer II
- Membran (kurz in Methanol aktivieren, in MQ wässern)
- Gel
- 16 Munktell-Filter in Kathodenpuffer
Blot: 20min bei 299mA (76V --> 62V) Vorsicht: Wenn seitlich Gasblasen aus dem Sandwich kommen abstellen!
Abklatsch
Bearbeiten- Glasplatte als Unterlage
- Schritte 2-6 wie bei Elektroblot
- Glasplatte Auflage
- Für ca. 10 min eine gefüllte 1l-Flasche oder einen ähnlich schweren Gegenstand( bis Max. 5kg!) auf den Stapel stellen
Wet-Blot
BearbeitenBlot wird in der Vertikalen in Wet-Blot-Puffer durchgeführt. Vorteil: Protein wird komplett auf die Membran übertragen. Aufbau des Schlittens (in Draufsicht):
- Schwamm (an Kathode)
- 2× Munktell-Filter
- SDS-Gel
- PVDF-Membran
- 2× Munktell-Filter
- Schwamm (an Anode)
Schlitten in die Wet-Blot-Kammer (BioRad) einsetzen. 30 mA, über Nacht, 4°C.
Blotentwicklung (bei Verwendung des mit der Alkalischen Phosphatase gekoppelten 2.AK)
Bearbeiten- Bei Bedarf ca. 10 Minuten in Ponceau-Rot geben, mit Wasser abspülen, um alle Proteine vorrübergehend anzufärben
Hinweis: Die Ponceaux-Färbung toleriert kein SDS, daher Membran ggf. vor der Färbung kurz in Methanol legen. - Blot abblocken (1h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C) mit
- 2,5g Milchpulver in 50 ml 1x TBS-Puffer oder
- 1% BSA/TBS (oder BSA/PBS) + 0,02%NaN3 (d.h. 80 µl 25% NaN3 auf 100 ml Lösung)
[kann mehrmals verwendet werden; im Kühlschrank lagern]
- TBS/Tween-Mix ansetzen (0,05% v/v Tween-20)
- 50 µl Tween; Pipettenspitze vorher abschneiden!
- 100 ml TBS; Endkonzentration 0,05% Tween
- Blot 30 min mit TBS/Tween waschen; oft wechseln
- Mit dem primären Antikörper* für 1h auf Schütteltisch inkubieren
- 5x je 5 min mit TBS/Tween waschen
- Mit dem sekundären Antikörper* für 1 h auf Schütteltisch inkubieren
- 5x je 5 min mit TBS/Tween waschen
- Entwickeln
- 33 µl BCIP und 66 µl NBT in 10 ml Blot-Entwicklungspuffer in Schale geben
- Blot einige Sekunden in Schale legen, bis Banden sichtbar werden
- Abspülen mit Wasser stoppt enzymatische Reaktionen
- Blot ist lichtempfindlich, daher in Alufolie aufbewahren
* Primärer und sekundärer Antikörper werden in TBS mit 1%BSA und 0,02% Na-Acid angesetzt und nach dem Gebrauch nicht verworfen (Aufbewahrung bei 4°C).
Materialien
BearbeitenBlotten
Bearbeiten- 24 Munktell-Filter (5,5x8,5 cm)
- Milchpulver oder BSA
Blotpuffer | 1l 1x | 1l 5x |
---|---|---|
TRIS (Endkonzentration 50 mM) | 6,055 g | 30,275 g |
Glycin (Endkonzentration 40 mM) | 3,003 g | 15,015 g |
Mit MQ auffüllen, optional auf pH 9.1 einstellen |
Elektroblot 2. Variante
Bearbeiten- Anodenpuffer I: 0,3M Tris, 10% Methanol pH 10,4
- Anodenpuffer II: 25mM Tris, 10% Methanol, pH 10,4
- Kathodenpuffer: 25mM Tris, 10% Methanol, 40mM Glycin, pH 9,4
Wet-Blot-Puffer
Bearbeiten1×, 2l
- 25 mM Tris (6,05g)
- 192 mM Glycin (28,8g)
- 20% Methanol tech. (400 ml)
- 0,02% SDS (0,4g = 2ml(20% SDS))
Blotentwicklung
BearbeitenBlot-Entwicklungspuffer | 1000 ml | 500 ml | 250 ml |
---|---|---|---|
100 mM Tris (MW=121,4) | 12,14 g | 6,06 g | 3,03 g |
100 mM NaCl (MW=58,44) | 5,884 g | 2,92 g | 1,46 g |
5 mM MgCl2 . 6H2O (MW=203,3) | 1,017 g | 0,508 g | 0,254 g |
Mit MQ auffüllen, mit HCl auf pH 9.5 einstellen |
- TBS-Puffer, Tween
- Primärer und sekundärer Antikörper
- BCIP (Brom-Chlor-Indoylphosphat) [100 mg in 2 ml DMF lösen => Endkonzentration 20 mg/ml]
- NBT (Nitro-Blue-Tetrazolium) [250 mg in 5 ml (3,5 ml DMF + 1,5 ml H2O) lösen => Endkonzentration 50 mg/ml]
- DMF (DiMethylFormamid)
- ggfs. Ponceau-Rot