Institut:Biochemie/Schägger-Gel
Ein Schägger-Gel ähnelt einem SDS-Gel, trennt aber kleine Proteine bzw. Peptide besser auf. Im Gegensatz zum SDS-Gel besteht das Schägger-Gel aus drei statt zwei "Lagen".
Methode
Bearbeiten- Je 5 ml Trenngel und Spacergel mit APS+TEMED ansetzen
- Das Trenngel in die Kassette geben, bis es die Kassette knapp über die Hälfte füllt
- Nach 5 Minuten das Spacergel vorsichtig auf das Trenngel schichten, die Kassette dabei bis zur 3/4-Markierung füllen
- Das Spacergel vorsichtig mit MQ überschichten
- Nach ca. 45 Minuten das Wasser abgiessen
- 5 ml Sammelgel mit APS+TEMED ansetzen
- Die Kassette mit dem Sammelgel komplett füllen
- Kamm einsetzten
- 30 Minuten polymerisieren lassen
- Währenddessen Heizblock auf 95°C stellen, Proben ca. 5 min kochen
- Unterseite der Slots mit Stift markieren
- Kamm und Klebestreifen entfernen
- Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
- Mitte der Laufkammer mit Kathodenpuffer füllen, so dass die Slots gut bedeckt sind
- Den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Anodenpuffer füllen
- Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in Kathodenpuffer spülen
- Mit 40 Volt laufen lassen (bis zu 18 Stunden)
- Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
- Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
- Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen
Weitere mögliche Schritte:
- Gel auf Lichttisch fotographieren
- Western Blot
- Gel trocknen
- Gel und Einmach-Folie in MQ legen
- Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
- Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
- Auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
- Mit Vakuum für ca. 3 h mit Hitze, danach für ca. 1 h ohne Hitze trocknen
- Falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen
Materialien
BearbeitenGele
BearbeitenJe 60 ml Endvolumen | Trenngel 16% | Spacergel 10% | Sammelgel 4% |
---|---|---|---|
30% Acrylamid | 32 ml | 20 ml | 8 ml |
3M Tris/0,3% SDS
pH 8,45 |
20 ml | 20 ml | 15 ml |
Glycerin | 8 ml | 0 ml | 0 ml |
MQ | 0 ml | 20 ml | 37 ml |
0,3% SDS = 0,18g SDS auf 60 ml 3M TRIS |
Puffer
Bearbeiten- Anodenpuffer
- 0,2M TRIS (6 g auf 250 ml)
- Mit HCl auf pH 8,9 einstellen
- Kathodenpuffer
- 0,1M TRIS (3 g auf 250 ml)
- 0,1M Tricine (4,5 g auf 250 ml)
- 0,1% SDS (0,25 g auf 250 ml)
- Mit HCl auf pH 8,25 einstellen