Poly-Acrylamid-Gel-Elektrophorese zur elektrophoretischen Auftrennung von Proteinen.
Die Triton-PAGE ist eine Methode zwischen der klassischen SDS-PAGE und der native PAGE. Auch hier werden Proteine eher nach sekundären Kriterien, wie Ladung, Glykosilierung und Struktur aufgetrennt.
- 10 ml Trenngel (+APS +TEMED) in Kassette geben
- mit etwas MQ bedecken
- warten bis das Gel fest wird (ca. 45 min)
- MQ abgießen oder mit Filterpapier entfernen
- Kassette mit Sammelgel (+APS +TEMED) füllen (ca. 5 ml)
- Kamm einsetzen
- warten bis das Gel fest wird (ca. 30 min)
- Unterseite der Slots mit Stift markieren
- Kamm und Klebestreifen entfernen
- Kassette in Laufkammer stellen (Slots zur Mitte hin orientieren)
- Mitte der Laufkammer mit Nativem-Laufpuffer füllen, so dass die Slots bedeckt sind; es darf kein Puffer auslaufen
- den äußeren Bereich der Kammer zu etwa 1/3 mit Laufpuffer füllen
- Proben mit Hamilton-Pipette in die Slots geben, nach jeder Probe in Laufpuffer spülen
- Laufzeit 90-120min bei 150mA bei 4°C
- Hamiltonpipette mit Ethanol spülen
- Gel entfernen, wenn die Lauffront sich dem unteren Ende nähert
- Kammer in den Ausguss entleeren, mit Wasser spülen
Weitere mögliche Schritte:
- Gel auf Lichttisch fotographieren
- Western Blot
- Gel trocknen
- Gel und Einmach-Folie in MQ legen
- Gel auf die feuchte Folie legen, Folie umklappen, so daß sie das Gel von beiden Seiten komplett bedeckt
- Gel in Folie zwischen zwei Pappdeckel legen
- auf Vakuumtisch legen, Vakuumpumpe einschalten (Waschflasche auf Eis stellen!)
- mit Vakuum für ca. 1 h mit Hitze, danach für ca. 15 min ohne Hitze trocknen
- falls das Gel zu früh entnommen wird (wellig), ca. 1 h in MQ einlegen, erneut trocknen
Natives Trenngel
8,5%
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10 ml
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200 ml
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3M TRIS pH 8.8
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1,85 ml
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37 ml
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20% Trition X-100
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50 µl
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1 ml
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60% Saccharose
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1,15 ml
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23 ml
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50% Acrylamid MQ
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1,7 ml 5,3 ml
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34 ml 106 ml
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40% Acrylamid MQ
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2,1 ml 4,9 ml
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42 ml 98 ml
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30% Acrylamid MQ
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2,8 ml 4,2 ml
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56 ml 84 ml
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Natives Sammelgel
5%
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10 ml
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200 ml
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0.5M TRIS, pH 6,8
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2,5 ml
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50 ml
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20% Trition X-100
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50 µl
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1 ml
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50% Acrylamid MQ
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1,0 ml 6,5 ml
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20 ml 130 ml
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40% Acrylamid MQ
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1,2 ml 6,3 ml
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24 ml 126 ml
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30% Acrylamid MQ
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1,6 ml 5,9 ml
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33 ml 117 ml
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Native PAGE Laufpuffer
Laufpuffer
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1×
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5×
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5×, 2L
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mM TRIS
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50 mM
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250 mM
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60,6g
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mM Glycin
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384 mM
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1920 mM
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288,3g
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Probenpuffer
Probenpuffer
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4×
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4×, 100µl
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0,5 M EDTA
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250 mM
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50 µl
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0,5 M Tris pH 6,8
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375 mM
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12,5 µl
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60% Saccharose
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16,5%
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27,5 µl
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1 M DTT
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0,1 M
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10 µl
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20% Trition X-100
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0,1 %
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0,5 µl
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etwas Bromphenolblau
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- APS=40% Ammonium-Persulfat (0,1g auf 250 µl ansetzen, hält ca. 2-3 Tage)
- ggfs. Einmach-Folie